一、适用范围

　　本操作方法适用配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。

　　二、方法概述及原理

　　饲料中粗蛋白质包括真蛋白质和非蛋白质两部分含氮物质，后者主要包括游离氨基酸、硝酸盐、铵盐等，不能或不易被动物吸收，故不能反映出饲料蛋白质对动物的真正营养价值。本方法是在凯氏定氮方法的基础上进行相应的前处理从而达到测定真蛋白的目的。

　　蛋白质经沸水提取并在一定碱性条件下，能与硫酸铜发生盐析作用而析出沉淀，此沉淀物不溶于热水，而非蛋白氮则易溶于水，用热水洗沉淀，将水溶性含氮物洗去，剩下的沉淀物再用凯氏定氮法测定，得出真蛋白质的含量。

　　三、仪器与试剂

　　粉碎机、40目分样筛、分析天平(感量0.1mg)、烧杯250ml、玻璃棒、漏斗(直径10cm)、

　　定性滤纸(中速，12.5cm，15cm)、可控温干燥箱、Hanon K1100F全自动凯氏定氮仪、

　　Hanon SH420石墨消解炉、可控温电炉

　　浓硫酸(98%)、硫酸铜(分析纯)、硫酸铜溶液(10%)、硫酸钾、氢氧化钠溶液(40%)、

　　氢氧化钠溶液(2.5%)、硼酸(20g/L，按混合指示剂：硼酸=1:100加入指示剂)、

　　甲基红-溴甲酚绿混合指示剂(1:5)、硫酸标准溶液(C(1/2H2SO4)=0.1mol/L)、

　　氯化钡溶液(5%)

　　四、实验步骤

　　1. 前处理

　　将风干饲料样品用饲料样品粉碎机粉碎，通过40目(孔径0.45 mm)筛，制得分析饲料样本，备用。

　　准确称取约0.5g试样(精确至0.000 1 g)置于250 mL烧杯中，加75mL蒸馏水，加热至沸，煮沸30min(保持75mL水)，加入2.5 %氢氧化钠溶液20 mL，10 %硫酸铜溶液20 mL，用玻璃棒充分搅拌均匀，微沸一段时间，冷却放置超过2 h。用定性滤纸过滤，然后用70~80 ℃热水冲洗沉淀5次以上，用 5%氯化钡溶液5滴和数滴盐酸检查滤液，直至不生成白色硫酸钡沉淀。将沉淀和滤纸放在65 ℃烘箱烘干。

　　将干燥后的沉淀连同滤纸一起放入消化管中，加入15mL浓硫酸，3g硫酸钾，0.2g硫酸铜，放在石墨消解炉上设置温度梯度升温消化(同时做空白试验)。

　　2.真蛋白的测定

　　将冷却后的消化管置于K1100F全自动凯氏定氮仪上，设置参数：硼酸20mL，碱 60mL，稀释水10mL，蒸馏5min。测得蛋白质含量即为真蛋白含量。

　　五、注意事项

　　1.洗涤时要用60-80℃左右的热水，可以减少洗涤次数。

　　2.必须要洗涤到氯化钡不再产生白色沉淀为止，以确定非蛋白氮成分洗涤干净。

　　3.沉淀要尽量烘干。