荧光显微镜原理及应用

　　(一)荧光显微镜的原理和结构特点 ：荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长 ，所以需加用激发滤片(一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片)，仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。

　　荧光显微镜就其光路来分有两种：

　　1.透射式荧光显微镜: 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上.这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱.所以对观察较大的标本材料较好。

　　2.落射式荧光显微镜这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。

　　荧光显微镜使用注意事项：

　　1、 严格按照荧光显微镜出场说明书要求进行操作，不要随便改变程序。

　　2、 最好在暗室中进行检验。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5~15min，待光源发出强光并稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。

　　3、 防止紫外线对眼睛的伤害，再调整光源时，应带上防护眼睛。

　　4、 检查时间以一次1-2hrs为宜，如果超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱;标本受紫外线照射3~5min后，标本荧光也明显减弱;所以最多不要超过2~3hrs。

　　5、 荧光光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应打开电扇或空调散热降温。换新灯泡应从开始使用就记录时间。等熄灭后欲在使用，待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。

　　6、 标本染色后立即观察，时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本保存在聚乙烯塑料袋中4度保存，可延缓荧光减弱时间。

　　7、 荧光强度的判断标准;一般分为四级，1： 无或可见微弱荧光，2：仅能见明确可见荧光，3：可见有明亮的荧光，4：可见耀眼的荧光。